多光子顯微鏡

在多光子顯微鏡（也稱為非線性或雙光子顯微鏡）中，以兩倍正常激發波長照射樣品。更長的波長是有利的，因為它們可以更深地穿透樣品進行 3D 成像，并且因為它們不會損壞樣品，從而延長樣品壽命。為了實現多光子激發，照明光束在空間上聚焦（使用光學器件），同時使用高能短脈沖激發光束以提高兩個（或更多）光子同時到達同一位置（即熒光團分子）的概率。

多光子顯微技術的例子包括二次諧波產生 (SHG)、三次諧波產生 (THG)、相干反斯托克斯拉曼光譜 (CARS) 和受激發射耗盡 (STED) 顯微技術。由于這些技術中的每一種都使用脈沖激光器，因此選擇能夠最大限度地減少脈沖色散的光學組件很重要，并且激光反射二向色鏡應具有低 GDD 特性。

如圖 2 所示，典型的系統由激發激光器、掃描和成像光學器件、靈敏檢測器（通常是光電倍增管）和用于將熒光與激光器分離并阻擋激光的濾光片（二向色分光鏡）組成從到達檢測器（發射濾光片）。

多光子成像系統提供的優勢包括真正的三維成像、對活組織內部深處進行成像的能力以及消除平面外熒光。

使用這種方法，可以對斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的熒光染料進行成像，甚至可以對樣品或組織中固有的熒光分子進行成像。多光子成像的缺點包括需要高峰值功率脈沖激光器，例如鎖模鈦：藍寶石激光器，并且直到現在，缺乏在整個發射范圍內提供足夠吞吐量的高性能濾光片。整個激光調諧范圍內的興趣和足夠的阻擋（圖 3）。

圖 1：來自暴露的小鼠皮層的雙色體內雙光子成像。NADH 熒光（紅色）和硫羅丹明標記的星形膠質細胞（綠色）使用 BrightLine FF01-680/SP 發射器和 FF665-Di01 二向色鏡拍攝。圖片由羅徹斯特大學醫學中心神經外科系 Karl A. Kasischke 和 Nikhil Mutyal 提供。

圖 2：多光子熒光顯微鏡的典型配置。

圖 3：多光子顯微鏡需要在非常寬的光譜范圍內控制光：從近紫外一直到近紅外。

針對多光子顯微鏡優化的 Semrock 濾光片Semrock 通過引入具有超高透射率、非常陡峭的邊緣和精心優化的阻擋的濾光片，為多光子用戶帶來了增強的性能。考慮到激發激光器和多光子成像系統的其他復雜元件通常需要多少投資，這些新的光學濾光片代表了一種簡單且廉價的升級，可以顯著提高系統性能。

BrightLine^®
發射濾光片提供從近紫外到近紅外的清晰透射（圖 4）。事實上，與傳統濾光片的褐色色調相比，發射濾光片看起來像窗戶玻璃一樣清晰，而且 LWP 二向色鏡具有如此寬的反射帶，它們看起來像高反射鏡（圖 5）。發射濾光片還在 Ti:Sapphire 激光調諧范圍內提供深度阻擋，這對于實現高信噪比和測量靈敏度至關重要。

有時需要限制在任何給定時間檢測到的熒光發射光譜帶，特別是當使用多個熒光團標記樣品中的不同目標時。較窄的帶通濾光片非常適合此目的，Semrock 提供了多種此類帶通濾光片，可與多光子發射濾光片結合使用，幾乎不會丟失熒光信號。

由于非線性光學效應強烈依賴于激光脈沖的峰值強度，因此當脈沖展寬（以及隨之而來的峰值強度降低）保持在最/低限度時，會產生*的成像。BrightLine FF670-SDi01 和 FF720-SDi01 短波通二向色分束鏡旨在將激發激光反射到樣品，同時提供返回的近紫外和可見熒光或 SHG 信號的出色傳輸。與從這些分束鏡反射的激光相關的群延遲色散 (GDD) 非常低。例如，對于 FF670-SDi01 濾光片，100 fs 變換限制高斯脈沖在整個激光波長范圍內的加寬小于 2%，而對于 FF720-SDi01 濾光片在整個激光波長范圍內的加寬遠小于 1%。

圖 4：BrightLine 多光子濾光片提供近乎理想的性能，如“近紫外和可見光"發射濾光片 FF01-680/SP 和二向色鏡 FF665-Di01 的這些典型測量光譜所示。

圖5：圖 5： BrightLine 多光子濾光片非常清晰！

圖6：使用Semrock多光子濾光片研究表明熒光Ca 2+指示劑蛋白（FCIPs），用于在使用雙光子顯微鏡活細胞研究的Ca2 +動態的功率。表達熒光蛋白 CerTN-L15 的 2/3 層神經元的三維重建。

中間：3 張選定的圖像（每張在左側和右側分別用數字標記的深度拍攝）。圖片由慕尼黑工業大學神經科學研究所的 Olga Garaschuk 教授教授提供。（修改自 Heim 等人，Nat. Methods，4(2)：127-9，2007 年 2 月。）(Modified from Heim et al., Nat. Methods, 4(2): 127-9, Feb. 2007.)

光密度OD

光學密度（Optical Density或稱為 OD）是描述光通過高度阻擋的光學濾光片（當光的傳輸非常小時）的透過率的一種方便工 具。OD簡單地定義為對數（底為10）的負變量。變量在0和1之間變化(OD = – log10(T))。因此，透過率就簡單等于10的負OD值的 方 (T = 10– OD)， 左圖顯示了OD的影響：6個數量級（1000000次）的透過率變化，非常簡單地用介于0到6的數字來表示；下面中間 的示例表和右下的“法則"列表提供了一些方便的技巧，可以在 OD 和透過率之間快速轉換。將變量 T 乘以2（或除以10）等于減 去0.3（或加上1），就轉換成了 OD 。

光密度本底噪聲：

通過精心優化我們的測量設備和方法，Semrock能夠提供一些優化的寬帶光密度（OD）。以下是此網站上顯示的大多數測量數據的典型OD噪聲本底限制。

對于介于320和1120 nm之間的波長，接近或低于3e-7（光學密度6.5）的透射值受到測量噪聲的限制。

對于波長<320 nm且在1120-1500 nm之間的波長，接近或低于3e-6（光學密度5.5）的透射值受到測量噪聲的限制。

對于大于1500 nm的波長，接近或低于1e-5（光學密度5.0）的透射值受到測量噪聲的限制。

同樣，對于某些濾光片和/或某些阻擋波長范圍，顯示的本底噪聲僅為OD 4。